AbstractsBiology & Animal Science

Detection of Enteroviruses in Tissue Samples - Methods and applications in type 1 diabetes

by Maarit Oikarinen




Institution: U of Tampere : Diss
Department:
Year: 2015
Keywords: Enterovirus; tyypin 1 diabetes; haima; ohutsuoli; kudosvärjäykset; type 1 diabetes; pancreas; small intestine; tissue stainings
Record ID: 1144314
Full text PDF: http://tampub.uta.fi/handle/10024/97187


Abstract

Tyypin 1 diabetes (T1D) johtuu haiman insuliinia tuottavien beetasolujen tuhoutumisesta immunologisten mekanismien kautta. Tapahtumaketju, joka johtaa sairastumiseen, on monimutkainen ja vielä osittain epäselvä. Taudin puhkeamista edeltää pitkä oireeton vaihe, jonka merkkinä verenkierrossa esiintyy autovasta-aineita beetasolun rakenteita kohtaan. Geneettinen alttius määrittelee taipumuksen sairastua T1D:een, mutta myös ympäristötekijät ovat tärkeässä osassa taudin synnyssä. Enteroviruksia on pitkään epäilty taudin syntyyn myötävaikuttaviksi tekijöiksi. Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet T1D:n ja enterovirusten välisen yhteyden, ja virusten löytyminen diabeetikoiden haimasta ja muista kudoksista on vahvistanut epäilyjä enterovirusten osuudesta taudin synnyssä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää immunohistokemiaan ja in situ -hybridisaatioon perustuvia menetelmiä enterovirusten osoittamiseen sekä soveltaa näitä menetelmiä diabeetikoiden ja esidiabeetikoiden kudosnäytteiden analysointiin. Immunovärjäys yhdeksällä eri enterovirusvasta-aineella tai -vasta-aineyhdistelmällä sekä in situ -hybridisaatio viruksen RNA-genomiin sitoutuvalla koettimella optimoitiin formaliinilla fiksoiduille ja parafiiniin valetuille enteroviruksella infektoituja soluja sisältäville leikkeille. Vastaavasti immunovärjäys seitsemällä eri vasta-aineella tai vasta-aineyhdistelmällä optimoitiin jääleikkeille, ja menetelmien kyky tunnistaa eri enterovirustyyppejä selvitettiin. Useimmat vasta-aineet ja vasta-aineyhdistelmät sekä in situ -hybridisaatio toimivat hyvin ja osoittautuivat hyväksi työkaluksi enterovirusten osoittamiseen tämän tyyppisistä näytteistä. Enterovirusten ja eräiden immunologisten markkereiden esiintyvyyttä tutkittiin näillä immunohistokemiallisilla ja in situ -hybridisaatiomenetelmillä sekä RT-PCR-menetelmällä diabeetikoiden ja esidiabeetikoiden kudosnäytteistä. Haimanäyte tutkittiin lapselta, jolla oli todettu diabetekseen liittyviä saarekesoluvasta-aineita. Haiman morfologia oli normaali, ja ainoa merkki mahdollisesta immunologisesta reaktiosta oli beta2-mikroglobuliinin runsas tuotanto haiman saarekkeissa. Lapsen haimanäyte oli enteroviruspositiivinen kahdella eri enterovirusvasta-aineella testattuna, mutta in situ -hybridisaatio antoi negatiivisen tuloksen. Myös lapsesta otetut seeruminäytteet olivat enterovirusnegatiivisia RT-PCR-analyysissä. Virusten esiintyvyyttä tyypin 1 diabeetikoiden ohutsuolessa selvitettiin kahdessa eri tutkimuksessa. Ensimmäisessä tutkimuksessa kahdentoista diabeetikon ja kymmenen verrokin ohutsuolibiopsianäyte värjättiin enteroviruksen VP1-proteiiniin kohdistuvalla vasta-aineella ja viruksen genomin esiintymistä tutkittiin in situ -hybridisaatiolla. Kaiken kaikkiaan yhdeksän diabeetikkoa (75 %) ja yksi verrokki (10 %) olivat positiivisia joko immunohistokemialla tai in situ -hybridisaatiolla (p=0,004). Viruksen läsnäolo vahvistettiin RT-PCR:llä osassa tapauksista. Jälkimmäisessä tutkimuksessa sama tulos toistui suuremmassa aineistossa, johon kuului 39 diabeetikkoa…